红景天苷是传统中药红景天的核心活性成分，具有抗衰老、抗缺氧、保护心脑血管等显著功效，广泛应用于医药、保健品和化妆品领域。然而， 野生红景天生长周期长、分布受限及过度采挖导致资源濒危等问题限制了红景天苷的可持续供应。近日，皖西学院安徽省大别山中医药研究院与中山大学合作，建立了以廉价生物基原料L-酪氨酸为起始原料的多酶级联合成工艺，实现红景天苷高效生产，相关成果发表于国际知名期刊《International Journal of Biological Macromolecules》。  

研究团队受红景天天然合成路径启发，设计了一条“六酶级联”的人工途径。该途径  通过将L-酪氨酸进行脱氨、脱羧、还原、糖基化四步反应实现红景天苷的多酶级联合成（图1）。  对该多酶级联体系系统评价后发现，最后一步中糖基转移酶BlYjiC M6的稳定性较差（40℃下半衰期仅0.8小时），导致中间体酪醇堆积，限制了该级联反应体系的高效运行。  

图1 多酶级联反应路线设计

团队随后决定对糖基转移酶BlYjiC M6的稳定性进行改造。由于随机突变会产生大量的突变库，在没有高通量筛选的情况下，对其改造几乎是不可能完成的任务。因此，团队设计了基于计算机辅助的精准改造策略（图2）。首先，通过分析蛋白柔性区域、进化保守性等参数，锁定70个潜在突变位点；然后，采用序列一致性分析以及基于FoldX和Rosetta的虚拟突变技术，进一步将突变位点缩小到23个，通过体外验证成功筛选到9个热稳定性显著提高的单点突变子；最终，通过对优势单点突变进行迭代组合获得一株六点组合突变体TSM6（T304V/G307A/N309W/F123W/T344V/D271G），其40℃下半衰期延长134倍（达106.8小时）  ，熔解温度提高13℃ ，表明糖基转移酶的稳定性获得了极大提高。

图2 基于计算机辅助设计的糖基转移酶改造流程

分子动力学研究表明，突变子的RMSD值显著小于原始酶，表明突变后蛋白变得更加刚性（图3A）；RMSF结果表明突变后蛋白四个区域的氨基酸残基波动显著降低，其中Zone1、Zone2、Zone4是位于蛋白质表面的loop区域，而Zone3则是位于蛋白质内部的α螺旋（图3B、3C、3D）。疏水作用分析发现，T304V、G307A、N309W突变导致该α螺旋的疏水作用获得了很大提高，使得在水相中突变子能够更好的维持其紧凑结构（图3E）。此外，氢键作用分析发现突变位点附近新增了两条氢键，并且氢键长度在动力学模拟过程中保持在4Å范围内，证明新增的氢键能够稳定存在，这可能是导致其稳定性增强的另一个原因（图3F、3G）。 

图3 热稳定性机制解析

在获得糖基转移酶热稳定性突变子TSM6后，团队将多酶级联体系中的6个酶分为3个模块在大肠杆菌中进行共表达，并通过优化模块表达强度获得最优共表达菌株Strain 14（图4A、4B、4C）。随后，采用CRISPR/Cas9技术敲除大肠杆菌自身竞争途径对羟基苯乙醛基因FeaB成功获得重组菌株Strain 14M（图4D、4E、4F）。最后，通过优化催化工艺在5 L反应器上红景天苷产量达到12.5 g/L，L-酪氨酸转化率达到85.0%（图4G）。采用大孔吸附树脂纯化后产物HPLC纯度>99%，总回收率80.5%（图4H）。相比传统提取，节省90%以上原料成本，极大的减少对野生资源的依赖。

图4 构建多酶级联全细胞催化剂

综上，该研究基于计算机辅助设计成功实现了糖基转移酶的热稳定性的增强，在此基础上首次构建了从低成本的L-酪氨酸到高价值红景天苷的多酶级联合成体系（图 11）。本研究不仅攻克了红景天苷生物合成的技术难题，更展现了中药资源保护与生物制造融合的创新路径。这项技术为珍稀中药成分的规模化生产提供了新范式，未来将拓展至其他高值天然产物。

皖西学院安徽省大别山中医药研究院韩邦兴教授和中山大学海洋科学学院尹新坚副研究员为共同通讯，安徽省大别山中医药研究院青年教师李国四为论文第一作者。该研究得到了国家重点研发计划和国家自然科学基金等项目的资助。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.140261

文章引用：Li, G., Yi, S., Wang, H., Qiu, H., Wang, W., Gao, L., Xu, Q., Han, B., & Yin, X. (2025). Salidroside production through cascade biocatalysis with a thermostability-enhanced UDP-glycosyltransferase. International Journal of Biological Macromolecules, 140261.

（文图/李国四  预审/易善勇  审核/韩邦兴）